苯甲酸鈉又稱安息香酸鈉,是廣泛應(yīng)用于食品及碳酸飲料產(chǎn)業(yè)中的防腐劑。多年來(lái)世界上大多數(shù)國(guó)家一直允許用SB作為食品防腐劑,最大允許量在0.15~0.25wt%之間,在美國(guó),SB的最大允許量為0.1wt%。隨著食品工業(yè)的發(fā)展,食品中使用防腐劑的現(xiàn)象十分普遍。過(guò)去曾認(rèn)為SB對(duì)人體無(wú)毒,但最近的研究表明,其可造成人體組織器官或機(jī)能的損害,具有遺傳毒性,使染色體分裂出現(xiàn)異常,使染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)畸變以致斷裂并且會(huì)產(chǎn)生肝硬化、肌肉損傷甚至致癌,Tsay等發(fā)現(xiàn)SB能使斑馬幼蟲(chóng)發(fā)生畸變。長(zhǎng)期飲用含有SB的碳酸飲料易使兒童產(chǎn)生多動(dòng)癥。因此,苯甲酸鈉的生物安全性和對(duì)人體的危害程度必然要引起我們的重視。

將Balb/c系小鼠斷髓處死,在超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌分離雙側(cè)腋窩、鎖骨下、腹股溝淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié),PBS清洗,去除被膜,機(jī)械研磨,于200目不銹鋼網(wǎng)篩過(guò)濾。收集細(xì)胞,用4oCPBS1200r/min離心5min。洗滌細(xì)胞2次,重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%FBS及50μmol/Lβ-巰基乙醇),調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL。臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活力,活細(xì)胞數(shù)占98%。添加SB溶液至淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中,終濃度分別為0wt%、0.05wt%、0.1wt%和0.2wt%。將細(xì)胞在24孔板接種后放置于37oC、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h、6h、12h、18h。

樣品制備分別取與不同濃度SB作用1h、6h、12h、18h后的淋巴細(xì)胞,滴于新剝離的云母片上,使其自然鋪展,吸附10min,然后用2.5%的戊二醛(日本京都產(chǎn))固定15min,用蒸餾水沖洗3次,室溫自然干燥。

AFM成像將制備好的樣品置于AFM(AutoprobeCPResearch,Thermomicroscopes公司,USA)的XY掃描臺(tái)上,用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域,在空氣中室溫下利用接觸或非接觸模式成像。AFM圖像僅經(jīng)過(guò)自帶軟件(IP2.1版)的平滑處理,以消除掃描方向上的低頻背景噪音。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)AFM掃描成像,獲得了正常淋巴細(xì)胞、與不同濃度SB作用不同時(shí)間后的淋巴細(xì)胞的拓?fù)湫蚊矆D(Topography)和誤差信號(hào)圖(Errorsignal),并分別對(duì)其表面超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了掃描分析,觀察細(xì)胞數(shù)超過(guò)30個(gè)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),上述3種淋巴細(xì)胞均呈不同程度的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。正常淋巴細(xì)胞呈較為規(guī)則的圓形,中間隆起,細(xì)胞表面總體較為平滑,高度在1.8~2.5μm之間,直徑約為8~10μm。而與不同濃度SB作用后的淋巴細(xì)胞體積明顯發(fā)生變化。高度減少,細(xì)胞表面形態(tài)結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,中間部位出現(xiàn)明顯破裂并且凹陷,呈“Y”型結(jié)構(gòu),邊緣能觀察到有細(xì)微損傷分布,并且隨著SB濃度的增加,細(xì)胞形態(tài)進(jìn)一步發(fā)生改變,呈中間凹陷狀,細(xì)胞邊緣向四周扁平鋪展。細(xì)胞表面球狀顆粒進(jìn)一步增多,表面粗糙度增大,細(xì)胞高度明顯減少,直徑增加(高度由2μm逐漸減少至1μm,直徑由6μm逐漸增加至12μm)。對(duì)其局部小范圍進(jìn)行觀察,AFM能清楚地觀察到細(xì)胞膜密集的顆粒狀突起物以及大量的孔洞,其中凹凸不平的細(xì)胞表面分布著大量小顆粒。選取不同細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)圖的整個(gè)區(qū)域(5μm×5μm)進(jìn)行測(cè)量,與SB作用后淋巴細(xì)胞的四個(gè)參數(shù)值均明顯與正常淋巴細(xì)胞不同;對(duì)淋巴細(xì)胞膜形成的大小不一的顆粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì),經(jīng)SB作用后的淋巴細(xì)胞膜形成的顆粒逐漸增大。同時(shí),隨著與SB作用時(shí)間的延長(zhǎng),淋巴細(xì)胞出現(xiàn)的變化與上述情況類似,即作用時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞損傷越嚴(yán)重,淋巴細(xì)胞的表面粗糙度也逐漸增加。

AFM是樣品表面信息的收集工具,較易獲得細(xì)胞的形貌、超微結(jié)構(gòu)及其生化反應(yīng)后細(xì)胞形態(tài)變化等信息,是研究細(xì)胞損傷的有力工具。淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要細(xì)胞成分,其形態(tài)結(jié)構(gòu)與其功能息息相關(guān)。因此利用AFM研究淋巴細(xì)胞與外界環(huán)境相互作用前后細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞膜的變化,對(duì)了解淋巴細(xì)胞的生理功能具有十分重要的意義。

蘇州飛時(shí)曼精密儀器有限公司成立于2013年，坐落在美麗的蘇州高新區(qū)科技城，是一家起點(diǎn)高、前瞻性強(qiáng)的研發(fā)和制造型高科技企業(yè)。公司的核心研究方向?yàn)楣?、機(jī)、電、算一體化的微納米檢測(cè)設(shè)備、先進(jìn)的醫(yī)療儀器。飛時(shí)曼作為國(guó)內(nèi)自主品牌、原子力顯微鏡廠家，其主要產(chǎn)品有：原子力顯微鏡系列（多模式原子力顯微鏡 FM-Nanoview1000AFM、一體式原子力顯微鏡 FM-Nanoview6800AFM、拉曼原子力顯微鏡一體機(jī) FM-NanoviewRa-AFM、光學(xué)原子力顯微鏡一體機(jī) FM-NanoviewOp-AFM、教學(xué)型原子力顯微鏡 FM-Nanoview T-AFM、教學(xué)型掃描隧道顯微鏡 FM-NanoviewT-STM、工業(yè)型原子力顯微鏡 FM-NanoviewLS-AFM、拉曼光譜儀RM5000、拉曼光譜儀RM8000、拉曼光譜儀RM9000）。2015年，公司獲得江蘇省高新技術(shù)企業(yè)認(rèn)證，擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)30多項(xiàng)，研發(fā)的多款產(chǎn)品被評(píng)為高新技術(shù)產(chǎn)品，并通過(guò)CE、ISO9001、SGS認(rèn)證。